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由传染性病原体引起的犊牛腹泻与养牛业的经济损失密切相关。本研究的目的是确定韩国本土犊牛(KNC)腹泻的病原和流行病学特征。总共调查了207头日龄小于7月龄的腹泻犊牛。采用聚合酶链式反应(PCR)或实时聚合酶链式反应(real-time PCR)检测从直肠收集的粪便样本是否存在致病因子，并统计卵囊数量。从207例腹泻犊牛中的164例中检测出14种病原体，轮状病毒检出率最高(34.8%)，其次是艾美耳球虫(31.7%)，大肠杆菌(22.0%)，贾第鞭毛虫(14.0%)，魏氏梭菌(9.8%)，牛病毒性腹泻病毒(8.5%)，冠状病毒(7.9%)，隐孢子虫(7.3%)，环状病毒(6.7%)，细小病毒(5.5%)，诺如病毒(4.9%)，牛嵴病毒(1.8%)，腺病毒(1.2%)和沙门氏菌(0.6%)。164头犊牛中约95头(57.9%)感染了单一致病因子，42.1%感染了多种致病因子。感染单一病原体和感染多种病原体的犊牛死亡率无显著差异。轮状病毒、艾美耳球虫、牛嵴病毒和贾第鞭毛虫引起的腹泻在发病年龄上有显著差异，轮状病毒或魏氏梭菌引起的腹泻在不同季节间有显著差异。这项研究有助于了解犊牛腹泻，为制定有效的疾病预防和控制策略提供帮助，特别是在韩国东部省份。
介 绍
由传染性病原体引起的犊牛腹泻导致犊牛死亡、生长迟缓和治疗费用增加，给养牛业带来巨大经济损失[1]。犊牛腹泻与个体健康状况、管理方法、饲养环境等多种复杂因素有关，也与感染性病原体有关。断奶前犊牛50%以上的死亡率与腹泻疾病有关，大多数病例发生在1月龄以内的犊牛[2]。
犊牛腹泻的最大原因是出生后初乳中的抗体迅速减少。韩国本土犊牛也容易腹泻，原因是初乳产量低，初乳中免疫球蛋白浓度低[3,4,5]。
已知病毒、细菌和原生动物可引起传染性腹泻，可以引起单一感染或引起混合感染增加损害。轮状病毒是全球犊牛腹泻的主要病毒病原[6]，然而，其他几种病毒，包括冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、腺病毒、牛嵴病毒、诺如病毒、细小病毒和轮状病毒，已被确认为引起腹泻的治病病原体[3,7,8,9,10,11,12,13]。细菌性腹泻的主要病原体是大肠杆菌、梭状芽胞杆菌和沙门氏菌[3,14,15,16]。由原生动物引起犊牛腹泻的病原体包括艾美球虫属，贾第鞭毛虫属，隐孢子虫[3,17,18,19,20,21]。
饲养环境可能会影响腹泻的流行。在周期性繁殖中，犊牛在出生后很短的时间内，腹泻往往由于病原体污染到环境以及粪便和口腔造成感染发病。寒冷冬季出生的新生犊牛腹泻，由于对环境的适应能力较差，体温较低，免疫力较差，极易患病[22]。
尽管病原体不同，但腹泻的临床症状非常相似。因此，对腹泻病因的识别和适当的治疗，采取准确的预防措施是至关重要的。已有多项研究揭示了犊牛的病原与腹泻之间的关系[1]。然而，在韩国，对犊牛腹泻的致病因子进行的小规模研究较少[2,17]。因此，有必要明确韩国犊牛腹泻的病原和流行病学特征。在这里，通过评估韩国犊牛腹泻粪便样本中14种感染性病原体的流行率，研究犊牛腹泻的病原和流行病学。
材料和方法
动物
为了调查犊牛腹泻的病原和流行病学，2014年7月至2016年6月，在韩国东部道(江原道和庆北道)的96个农场共对207头210日龄以下腹泻的犊牛进行了研究。207头犊牛的平均年龄分别为33.73±42和20±42日龄。总的来说，韩国本土牛的繁殖环境与人工饲养水平各不相同，所有调查的养殖牛场都不包括放牧，而是被圈养在有屋顶的牛棚中，牛棚地板上铺有锯末。在不同的养殖环境中，牛棚地板的清洁度各不相同，没有具体的记录，这项回顾性研究得到了江原国立大学动物保护和使用机构委员会的审查和批准(KW-190207-1)。
临床检查
收集临床和流行病学资料，记录患牛的病史，包括农场、品种、性别、年龄、季节、恢复期和预后。对每头患牛进行体检。粪便样本被分为糊状、水样、粘液和出血性。
腹泻病原体的检测
为了鉴别犊牛腹泻的病原体，从直肠中收集了207份腹泻粪便样本，并在冷藏条件下转移到实验室。所有用于检测腹泻病原体的实验都在动植物检疫局(APQA，韩国)动物疾病诊断处(ADDD)进行。
使用Patho Gene-spin DNA/RNA提取试剂盒(iNtRON Biotechnology, Inc.，Korea)根据制造商说明从粪便样本中提取DNA和RNA。使用i-BD多重检测试剂盒(iNtRON Biotechnology, Inc.)对BVDV、冠状病毒和轮状病毒进行实时聚合酶链式反应(RT-PCR)检测。此外，对腺病毒、诺如病毒、牛嵴病毒、细小病毒和环状病毒进行RT-PCR检测，如前所述[9,23,24,25]。
致病性细菌大肠杆菌和沙门氏菌，按照以前研究中提供的方案培养[26,27]。将粪便样本接种在麦康凯培养基 (BBL, USA)和血琼脂培养基(Asan Pharmaceutical Co.，Ltd.，Korea)上，在37°C条件下培养24小时，只有纯培养的菌落被鉴定为细菌，使用VITEK II系统(bioMérieux，法国)鉴定致病性大肠杆菌，如前所述检测大肠杆菌基因F5、F41、F17、eae、stx1、stx2、sta、hly、saa、invA[26,27,28,29,30]。菌落悬浮在200μl的水中并煮沸10分钟，离心后，将上清液用作PCR反应的模板，扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳显示，用溴化乙锭染色。沙门氏菌的分离鉴定，将粪便样本接种在9 ml Rappaport-Vassiliadis (RV) R10肉液(BD, USA)中，并在42°C下培养24小时。将充满RV培养物的环状条状标记在CHROMagar沙门氏菌(CHROMagar, France)上，用PCR检测沙门氏菌的invA基因。
魏氏梭菌分离鉴定。魏氏梭菌根据先前的研究进行[30]，将样品与等量100%酒精混合，室温静置1 h，进行酒精杀灭，3800×g离心10 min，将颗粒接种于选择性培养基(CDSA, BD)， 37°C厌氧培养48 h以上。未进行酒精杀灭预处理的样品接种在约1 ml TCCFB(含0.1%牛磺酸钠的环丝氨酸-头孢西丁果糖肉汤)中，在37℃下培养7天。将选择性培养基上疑似独特的菌落继代培养到羊血琼脂上，然后进行DNA纯化。进行PCR检测，以确认分离的魏氏梭菌。
为了检测和计数艾美球虫卵囊，使用硝酸钠在比重为1.18的情况下[31]，通过粪便浮选技术对卵囊进行浓缩。检测隐孢子虫，根据制造商的说明，使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Germany)从粪便样本中提取DNA，并在- 20°C保存直到使用，隐孢子虫(Cryptosporidium spp) 18S rRNA，使用引物组合18SiF/18SiR进行扩增，如前所述[32]。为了从十二指肠贾第鞭毛虫中扩增β-贾第丁基因片段，使用两个引物集G7/G759和G7n/G759n进行巢式PCR，如前面描述的[33]。
统计方法
使用SPSS (IBM SPSS Statistics, Desktop Base, v22.0；IBM Corporation, USA)软件。在腹泻犊牛中检测到病原体的流行率，分为以下8个年龄组：<1周龄、1-2周龄、3-4周龄、5-6周龄、7-8周龄、9-10周龄、11-12周龄和≥13周龄。季节分组为春季(3 - 5月)、夏季(6-8月)、秋季(9-11月)和冬季(12-2月)[34]。腹泻分为糊状、水样、粘液性和出血性。艾美耳球虫的统计，根据每克粪便卵囊数(OPG)确定感染程度如下：轻度感染(OPG 1)，OPG < 1000；中度感染(OPG 2)，1000≤OPG < 10000；重度感染(OPG 3)，OPG≥10,000[35]。采用卡方检验分析各病原引起的腹泻患病率、发病年龄和发病季节的差异，P<0.05的值被认为具有统计学意义。
结果
犊牛腹泻病原菌的流行率
在207头腹泻犊牛中，有164头(79.2%)检测到腹泻病原体。其余的腹泻犊牛被分为以下诊断类别：皱胃嵌塞(n=6)、皱胃溃疡(n=3)和其他因素，其中包括原因不明的腹泻和由于粪便样本不足而未检测出的病原体。
在207头腹泻犊牛中，有164头检测到14种病原体。轮状病毒是最常见的病原(57/164头犊牛，34.8%)，其次是艾美耳球虫(52/164, 31.7%), 大肠杆菌(36/164,22.0%)，贾第鞭毛虫属(23/164, 14.0%)，梭状芽胞杆菌（16/164,9.8%)，BVDV(14/164, 8.5%)，冠状病毒(13/164,7.9%)，隐孢子虫(12/164, 7.3%)，环状病毒(11/164,6.7%)，细小病毒(9/164,5.5%)，诺如病毒(8/164,4.9%)，牛嵴病毒(3/164,1.8%)，腺病毒(2/164,1.2%)和沙门氏菌(1/164, 0.6%)。
病毒(117/164,71.3%)是最常见的病原体，其次是原生动物(87/164,53.1%)和细菌(53/164,32.3%)。虽然检测到其他几种致病菌，但轮状病毒、艾美耳球虫、贾第鞭毛虫、大肠杆菌、隐孢子虫、魏氏梭菌、BVDV和冠状病毒是犊牛腹泻的主要病原体。
164头犊牛中有95头(57.9%)感染了单一病原体，69头(42.1%)感染了多种病原体。164头犊牛中有48头(29.3%)是单纯感染病毒，18头(10.9%)和29头(17.7%)分别是单纯感染细菌和原生动物(表1)。
表1.韩国本土犊牛腹泻(n=164)中，感染单一病原体的犊牛患病率(n=95)
在混合感染病例中(164头犊牛中69头，42.1%)，53头犊牛(32.3%)感染双病原，分别为9头(5.5%)、6头(3.7%)和1头(0.6%)感染三种病原、四种病原和五种病原(表2)。艾美耳球虫(32/164, 19.5%)、轮状病毒(29/164,17.7%)和大肠杆菌(23/164,14.0%)是混合感染犊牛中最常见的病原(表3)。大多数致病因素与混合感染有关，而不是单一感染。
表2.腹泻的韩国本土犊牛(n=164)感染混合致病因子的发生率(n=69)
 表3.腹泻的韩国本土犊牛(n=164)中感染单一或多种病原的发生率(n=257)
发病犊牛腹泻根据发病年龄分布
为了根据病因确定腹泻的发病年龄，对164头犊牛进行了病原和腹泻发病年龄的检测。平均腹泻发病年龄为33.7±42.0天，最小发病年龄为2天，最大发病年龄为210天。
按腹泻发病年龄划分的主要病原分布见（表4）。轮状病毒引起的腹泻的发生随着犊牛年龄的增加而逐渐减少。9周龄及以上未检出轮状病毒。轮状病毒引起腹泻的发生率随发病年龄有显著差异(p<0.001)。
表4.腹泻发病年龄的主要病原分布
在20日龄内的犊牛未见艾美耳球虫引起腹泻，由艾美耳球虫引起的腹泻(31/52，59.6%)以3~6周龄的犊牛最为常见。艾美耳球虫引起的腹泻的发生，发病年龄有显著差异(p<0.001)。
贾第鞭毛虫引起的腹泻，发生在2~10周龄的犊牛。贾第鞭毛虫引起腹泻的发生，发病年龄差异显著(p=0.002)。
病毒和细菌病原主要在3周龄内的犊牛中检测到，但这些病原通常分布到8周龄。原生动物病原主要在3~10周龄的犊牛中检测到。
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